Laporan Praktikum Pembuatan Preparat dengan Metode Parafin

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Tubuh hewan secara morfologi terdiri atas unit sel, dan masing-masing sel dapat menggandakan kesatuan dengan adanya substansi antar sel. Kelompok sel-sel yang terdapat dalam tubuh hewan secara fungsional berbeda dengan kelompok sel yang lain. Kelompok sel tersebut  dikenal dengan jaringan. Jaringan menjalankan berbagai fungsi dalam tubuh makhluk hidup. Sel-sel atau jaringan tersebut dapat diamati dengan menggunakan metode parafin.

Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal irisan 6 – 8 µm. Metode pembuatan sediaan dengan penyelubungan parafin disebut juga sebagai metode embedding. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis dibandingkan dengan menggunakan metode yang lain. Metode parafin termasuk metode sayatan yang sering digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Preparat dengan metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanen baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.

Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pembuatan sediaan dengan metode parafin memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Berdasarkan uraian diatas maka perlu dilakukan praktikum pembuatan preparat dengan metode parafin.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini yaitu bagaimana mempelajari komponen penyusun jaringan atau organ yang disayat setebal 6 mikron.

C. Tujuan Praktikum

Tujuan yang ingin dicapai dari pelaksanaan praktikum ini yaitu untuk mengetahui komponen penyusun jaringan atau organ yang disayat setebal 6 mikron.

D. Manfaat Praktikum

Manfaat yang dapat diperoleh dari pratikum ini yaitu untuk mengetahui komponen penyusun jaringan atau organ yang disayat setebal 6 mikron.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroteknik atau teknik histologi ini akan dipelajari ilmu atau seni untuk mempersiapkan organ, jaringan atau bagian yang lainnya untuk dapat diamati dan dipelajari dengan lebih teliti. Pada umumnya untuk melihat jaringan atau organ ini dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada dasarnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian ataupun keseluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain diletakkan pada kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup yang direkatkan di atas spesimen  (Alyas, 2010).

Metode parafin adalah suatu cara pembuatan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut, dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, bila menggunakan metode ini (Santoso, 2002).

Pembuatan preparat histopatologi dibutuhkan bahan utama berupa jaringan segar, yang difiksasi dalam larutan formalin (BNF) 10%. Jaringan dipotong dan diatur dalam tissue cassates, dehidrasi secara otomatis dengan mesin dehidrasi, dikeringkan dengan mesin vaccum, dan diblok dengan cairan parafin, selanjtnya dipotong dengan mesin mikrotom.  Pewarnaan objek diwarnai secara manual dengan hematoksilin dan eosin. Pewarnaan tersebut akan memberikan keseimbangan warna biru dan merah dengan jelas pada jaringan, sehingga komponen sel dapat diidentifikasi dengan jelas (Muntiha, 2001).

Fiksasi merupakan suatu proses yang dilakukan untuk mempertahankan kondisi jaringan. Tujuan dari fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi sel seperti semula, untuk mencegah terjadinya otolisis, dan untuk mencegah pertumbuhan bakteri. Beberapa jenis bahan yang bisa digunakan sebagai bahan fiksasi suatu jaringan yaitu formalin, alkohol, larutan carnoi, larutan zenker, larutan helly, larutan bouin, omium, dan glutaraldehyde (Sudiana 2005).

Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertama-tama organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24 jam, dehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing dengan xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom. Kemudian diembedding yaitu merendam jaringan kedalam parafin cair dan parafin akan masuk keseluruh bagian jaringan (Andria, 2008)

III. METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Sabtu-Kamis, tanggal 12-26 Desember 2015, pukul 10.30-selesai WITA dan bertempat di Laboratorium Botani, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas halu Oleo, kendari.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Alat dan Kegunaan

No.	Nama Alat	Kegunaan
1	Rol film	Untuk tempat merendam kaca objek
2	Botol selai	Untuk menyimpan larutan alkohol
3	Botol balsem	Untuk tempat merendam organ
4	Cutter/pisau/silet	Untuk membedah
5	Isolasi bening	Untuk melapisi bakul agar tidak mudah sobek pada saat dimasukkan parafin
6	Holden	Tempat organ yang akan dicetak
7	Spatula / pinset	Untuk memindahkan organ
8	Bakul	Sebagai media penempelan parafin
9	Botol UC 1000	Untuk menyimpan larutan
10	Pipet tetes	Untuk memipet larutan
11	Kaca penutup	Untuk menutup objek
12	Kaca objek	Untuk meletakkan objek yang akan diamati
13	Oven	Untuk mencairkan parafin
14	Mikroskop	Untuk mengamati organ yang telah disayat
15	Kamera	Untuk memdokumentasikan hasil pengamatan
16	Alat tulis	Untuk mencatat hasil pengamatan
17	Toples	Untuk membius hewan mencit (Mus musculus)
18	Gunting bedah	Untuk membedah hewan mencit (Mus musculus)
19	Gunting kertas	Untuk menggunting kertas kalender
20	Slide warmer	Untuk menghilangkan parafin yang masih melekat pada organ

2. Bahan

Bahan yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 2.

Tabel 2. Bahan dan Kegunaan

No.	Nama Bahan	Kegunaan
1	Mencit (Mus musculus)	Sebagai hewan yang akan diambil organnya
2	Ovarium	Sebagai objek pengamatan
3	Hati	Sebagai objek pengamatan
4	Ginjal	Sebagai objek pengamatan
5	Kulit	Sebagai objek pengamatan
6	Kloroform	Sebagai bahan untuk membius
7	Larutan bouin	Sebagai larutan fiksasi
8	Xylol	Sebagai lartan penjernihan
9	Alkohol bertingkat (70%,80%,90%,96%,absolute)	Sebagai larutan dehidrasi
10	Parafin	Sebagai media penanaman organ
11	Hematoxylin dan eosin	Sebagai bahan pewarna
12	Tissue	Sebagai bahan untuk membersihkan alat
13	Kapas	Sebagai medium kloroform untuk membius hewan
14	Kertas kalender	Sebagai bahan untuk membuat bakul

C. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut

1. Membius mencit betina (mus musculus) dengan menggunakan kloroform.

2. Membedah mencit betina (mus musculus) serta mengambil organnya seperti hati, ovarium, ginjal dan kulit.

3. Memfiksasi organ dengan menggunakan larutan bouin selama 1 hari (ginjal dan kulit) dan 2 hari (ovarium dan hati).

4. Membilas organ dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, 96% dan absolut).

5. Melakukan penjernihan dengan menggunakan larutan toluol yang direndam semalam.

6. Merendam organ dalam parafin cair I, II dan III masing-masing selama 45 menit dengan suhu 58-60^o.

7. Merendam organ dalam parafin murni selama 3 menit.

8. Menanam organ dalam bakul dengan menggunakan parafin cair.

9. Menyimpan bakul yang berisi parafin kulkas selama 2 hari.

10. Menempel parafin pada holden dengan menggunkan parafin cair.

11. Menyayat parafin dengan menggunakan mikrotom.

12. Menempelkan sayatan pada kaca objek dengan menggunakan larutan campuran (putih telur dan acetolin).

13. Menyimpan kaca objek dalam slide warmer sampai kering.

14. Memasukkan kaca objek dalam larutan selama 15 menit dan meletakannya di kertas.

15. Menghilangkan bekas parafin yang masih menempel pada kaca objek dengan menggunakan alkohol absolut, 96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% dan 30% selama 15 menit.

16. Mewarnai organ dengan menggunakan pewarna hematoxylin erlich serta mencuci kaca objek dengan air mengalir selama 10 menit.

17. Menghilangkan alkohol (alkoholisasi) dengan menggunakan larutan alkohol 30%, 50%, 60% dan 70% selama 1 menit.

18. Mewarnai kembali organ dengan menggunakan pewarna eosin-Y, kemudian membilas dengan menggunakan larutan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan absolut selama 1 menit.

19. Menutup organ dengan menggunakan kaca penutup yang telah diolesi dengan Canada balsam dan dikeringkan selama 1 menit.

20. Mengamati dibawah mikroskop

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

B. Pembahasan

Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih 6 µm. Metode parafin sering digunakan karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Metode parafin dapat digunakan untuk pembuatan preparat permanen baik pada tumbuhan atapun hewan. Metode ini memiliki beberapa kelebihan dibanding metode lain, tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron, irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, dan prosesnya lebih cepat.

Praktikum pembuatan sediaan irisan jaringan hewan dengan metode parafin melewati beberapa tahap. Organ yang digunakan pada pratikum ini adalah ginjal, hati, kulit, ovarium, dan testis. Hewan yang diambil organnya adalah mencit (Mus musculus). Organ yang sudah diambil difiksasi menggunakan selama 1 hari untuk ginjal dan kulit dan 2 hari untuk ovarium dan hati. Fiksasi bertujuan untuk mematikan sel-sel organ namun strukturnya tidak rusak. Kemudian organ dibilas dengan menggunakan alkohol 70%.

Proses selanjutnya yaitu penghilangan air atau dikenal dengan dehidrasi, dengan alkohol bertingkat sampai alkohol absolut. Dehidrasi bertujuan menghilangkan air dari dalam jaringan. Selanjutnya tahap penjernihan dengan menggunakan larutan toluol yang direndam selama satu malam. Penjernihan bertujuan untuk membersihkan sisa-sisa alkohol. Setelah tahap penjernihan organ direndam dalam parafin cair I, II, dan III masing-masing 45 menit. Perendaman ini dilakukan dalam oven dengan suhu 58-60º. Kemudian direndam dalam parafin murni selama 3 menit. Tahap selanjutnya yaitu menanam organ dalam bakul dengan menggunakan parafin cair. Setelah parafin beku, kemudian ditempelkan pada holden.

Tahap selanjutnya yaitu penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 6 mikron. Kemudian penempelan sayatan pada kaca objek dengan menggunakam larutan campuran ( putih telur dan acetolin). Kemudian di masukkan dalam slide warmer sampai kering. Selanjtnya menghilangkan bekas parafin yang masih menempel pada kaca objek dengan menggunakan alkohol absolut, 96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% dan 30% selama 15 menit. Kemudian organ diwarnai dengan menggunakan pewarna hematoxylin erlich serta mencuci kaca objek dengan air mengalir selama 10 menit. Menghilangkan alkohol (alkoholisasi) dengan menggunakan larutan alkohol 30%, 50%, 60% dan 70% selama 1 menit. Kemudian mewarnai kembali organ dengan menggunakan pewarna eosin-Y, kemudian membilas dengan menggunakan larutan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan absolut selama 1 menit. Lalu menutup organ dengan menggunakan kaca penutup yang telah diolesi dengan canada balsam dan dikeringkan selama 1 menit. Tahapan terakhir diamati dibawah mikroskop. Hasil pengamatan dimikroskop, preparat yang dibuat semuanya gagal. Hal ini mungkin disebabkan kurangnya ketelitian dan keterampilan pada saat penyayatan

V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Kesimpulan dari praktikum ini yaitu komponen penyusun jaringan atau organ yang disayat setebal 6 mikron tidak dapat diamati karena preparat yang dibuat gagal.

B. Saran

Saran yang dapat diajukan pada praktikum ini yaitu diharapkan kepada semua praktikan ketika ada jadwal praktikum lanjutan untuk  datang semua, agar dapat mengetahui proses pembuatan preparat dengan metode parafin.

DAFTAR PUSTAKA

Alyas, A., 2010. Praktikum Pembuatan Preparat Menggunakan Metode Parafin, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Andria, A., 2008, Petunjuk Praktikum Mikroteknik, Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru.

Muntiha, M., 2001, Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi dari Jaringan Hewan dengan Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin, Balai Penelitian Veteriner, Bogor.

Santoso, H., 2002., Metode Pewarnaan (Histologi dan Histokimia), Bhrataro Karya Aksara, Jakarta.

Sudiana, K., 2005, Teknologi Ilmu Jaringan dan Imunohistokimia, CV. Sagung Seto, Jakarta.